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Tutorial para el llamado de variantes

Cristian Yáñez Lara Ingeniero Bioinformático Abril 2019

El siguiente protocolo está diseñado para ser implementado en el servidor genoma.med.uchile.cl dentro de la carpeta de cada usuario de bioinfo1. Además, se asume que ya se ejecutó el tutorial Tutorial para el filtro y alineamiento de lecturas.

##Procesamiento del alineamiento usando GATK

Usamos el programa Genome Analysis Toolkit (GATK) para el procesamiento en las siguientes etapas. De forma general los parámetros de GATK indican lo siguiente:

Parámetro Descripción -T Herramienta utilizada -R Archivo de referencia (el mismo usado en el alineamiento) -I Archivo de entrada el cual varía según la etapa del análisis -L Archivo .bed con las regiones target del experimento -o Archivo de salida generado el cual varía según la etapa del análisis

Recalibración de calidades de bases (Q) en lecturas

La etapa de calibración de puntuación de calidad de base (BQSR) aplica un modelo de error empíricamente preciso a las bases.

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T BaseRecalibrator \
-R reference.fasta \
-I muestra_sorted_RG.bam \
-knownSites dbSNP_hg19.vcf \
-o muestra_recal_data.table

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -I S10_sorted_RG.bam -knownSites /datos/reference/genomes/hg19_reference/dbSNP_hg19.vcf -o S10_recal_data.table

Esto crea un archivo "muestra_recal_data.table" que contienen los datos de covarianza que se utilizarán en el paso posterior.

Nota: Es importante proporcionar a GATK un conjunto de sitios conocidos con el parámetro "-knownSites", de lo contrario se negará a ejecutar el programa, en este caso se le proporciona las variantes de la base de datos dbSNP que posee GATK.

###Aplicar la recalibración a los datos de secuencia

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T PrintReads \
-R reference.fasta \
-I muestra_sorted_RG.bam \
--BQSR muestra_recal_data.table \
-o muestra_recal_reads.bam

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -I S10_sorted_RG.bam --BQSR S10_recal_data.table -o S10_recal_reads.bam

Llamado de variantes

Identificar variantes

Usando HaplotypeCaller, un llamador de variantes de GATK se pueden identificar dos tipos de variantes a partir del alineamiento procesado: polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) e inserción-deleción (InDels). Se obtienen las variantes almacenadas en un archivo “Variant Call Format” (VCF).

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T HaplotypeCaller \
-R reference \
-I muestra_recal_reads.bam \
--dbsnp dbSNP_hg19.vcf \
-stand_call_conf 30 \
-L "chr19" \
-o muestra_raw_variants.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T HaplotypeCaller -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -I S10_recal_reads.bam --dbsnp /datos/reference/genomes/hg19_reference/dbSNP_hg19.vcf -stand_call_conf 30 -L "chr19" -o S10_raw_variants.vcf

**Nota **: Para el curso práctico solo se calculan las variantes en el contig del cromosoma 19 (para disminuir tiempos de cómputo), para analizar el genoma completo se debe eliminar el parámetro -L "chr19" del comando.

Aplicar filtros a las variantes

El identificador de variantes GATK (HaplotypeCaller) es por diseño muy indulgente en las variantes de llamada para lograr un alto grado de sensibilidad. Esto es bueno porque minimiza la posibilidad de perder variantes reales, pero significa que debemos refinar el conjunto de llamadas para reducir la cantidad de falsos positivos, que puede ser bastante grande, lo que se hace en la etapa de filtrado de variantes.

Se ejecuta el proceso de filtrado por separado en SNPs e Indels, por lo que se dividen las variantes en archivos separados. Para SNPs e Indels se pueden aplicar los mismos filtros pero con distintos valores o parámetros. Para efectos prácticos solo filtraremos por profundidad de cobertura de las variantes.

Extraer SNPs

Extraemos los SNP del conjunto de variantes llamadas

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T SelectVariants \
-R reference.fasta \
-V muestra_raw_variants.vcf \
-selectType SNP \
-o muestra_RAW_SNP.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T SelectVariants -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -V S10_raw_variants.vcf -selectType SNP -o S10_RAW_SNP.vcf

Filtrar SNPs

Aplicamos el filtro al conjunto de SNPs

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T VariantFiltration \
-R reference.fasta \
-V muestra_RAW_SNP.vcf \
--filterExpression "DP <10" \
--filterName "FILTER" \
-o muestra_FILTERED_SNP.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T VariantFiltration -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -V S10_RAW_SNP.vcf --filterExpression "DP <10" --filterName "FILTER" -o S10_FILTERED_SNP.vcf

Extraer InDels

Extraemos los Indels del conjunto de variantes llamadas

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T SelectVariants \
-R reference.fasta \
-V muestra_raw_variants.vcf \
-selectType INDEL \
-o muestra_RAW_INDEL.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T SelectVariants -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -V S10_raw_variants.vcf -selectType INDEL -o S10_RAW_INDEL.vcf

Filtrar InDels

Aplicamos el filtro al conjunto de Indels

Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T VariantFiltration \
-R reference.fasta \
-V muestra_RAW_INDEL.vcf \
--filterExpression "DP <10" \
--filterName "FILTER" \
-o muestra_FILTERED_INDEL.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T VariantFiltration -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta -V S10_RAW_INDEL.vcf --filterExpression "DP <10" --filterName "FILTER" -o S10_FILTERED_INDEL.vcf

Combinar vcfs filtrados

Juntamos los archivos vcf anotados de SNPs e Indels en uno solo Comando:

java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
-T CombineVariants \
-R reference.fasta \
--variant:foo muestra_FILTERED_SNP.vcf \
--variant:bar muestra_FILTERED_INDEL.vcf \
-o muestra_FILTER_VARIANTS.vcf \
-genotypeMergeOptions PRIORITIZE \
-priority foo,bar

Ejemplo:

java -jar /opt/GenomeAnalysisTK-3.7-0/GenomeAnalysisTK.jar -T CombineVariants -R /datos/reference/genomes/hg19_reference/hg19.fasta --variant:foo S10_FILTERED_SNP.vcf --variant:bar S10_FILTERED_INDEL.vcf -o S10_FILTER_VARIANTS.vcf -genotypeMergeOptions PRIORITIZE -priority foo,bar

Nota: Las variantes que pasan los filtros se etiquetan como PASS y las que no pasan los filtros se etiquetan como FILTER. Para el curso (datos de prueba) se usó un filtro de cobertura de 10 lecturas, lo cual fue considerado mínimo para poder determinar de forma adecuada el genotipo, pero es arbitrario.

Anotación de variantes

En esta etapa se le añaden anotaciones a las variantes para predecir los efectos de estas en los genes humanos, como el cambio de sentido en la transcripción, etc. Para esto usamos el programa snpEff.

Los parámetros usados indican lo siguiente:

Parámetro Descripción
-csvStats Archivo de salida en formato csv
GRCh37.75 Versión del genoma referencia (hg19)
muestra_FILTER_VARIANTS.vcf Archivo vcf de entrada

Comando:

java -Xmx9g -jar snpEff.jar \
-csvStats muestra.csv \
GRCh37.75 \
muestra_FILTER_VARIANTS.vcf \
> muestra.vcf

Ejemplo:

java -jar /opt/snpEff/snpEff.jar -csvStats S10.csv GRCh37.75 S10_FILTER_VARIANTS.vcf > S10.vcf

Tarea

  1. Sigua este tutorial con los datos de la muestra previamente elegida. Todas las muestras son de pacientes, para los cuales se sospechaba de una mutación patogénica. Se realizó una secuenciación de un panel de genes con equipamiento MiSeq.
  2. En materiales y métodos del reporte, indique el número de genes incluidos en el panel e incluya una tabla con la lista de genes (consejo: revise el archivo regiones_blanco.bed). Indique también la región genómica total (en pares de bases) cubierta por el panel, o sea, el tamaño de las regiones blanco (consejo: revise su reporte qualimapReport.html).
  3. Realice el filtrado de variantes con dos filtros, DP<10 y uno adicional que usted proponga.
  4. Estime cuántas variantes son eliminadas por el filtro DP<10 solamente, y cuántas por ambos filtros.
  5. Genere un reporte e incluya una tabla con el número de variantes detectadas totales, SNPs, e INDELs. Para cada caso, indicar el número de variantes filtradas y que pasaron los filtros (solo uno, y ambos)
  6. Visualice una variante en IGV, mostrando tracks tanto para el alineamiento (bam) como las variantes detectadas (VCF).
  7. Asegúrese de usar un tamaño de ventana que muestre suficiente detalle como para leer la secuencia de referencia, pero sin un zoom excesivo para que se logre ver algo de contexto de secuencia. Ojalá que se vean otras variantes al rededor de la central. Incluya un track con los genes. Si no se ve ningún gen cercano a la variante, elija otra variante.
  8. En resultados, indique en formato de tabla el número de variantes detectadas según ubicación (intrónica, río arriba, río abajo, codificante con cambio de sentido, sin sentido, etc).
  9. Incluya el reporte completo generado por snpEff (html) como anexo.
  10. No se limite al uso de snpEff para la anotación. Asegúrese de anotar las variantes con al menos un software/base de datos extra de su elección. Muestre sus resultados.
  11. En la sección conclusiones, asegúrese de concluir algo sobre la muestra (presencia o no de mutaciones con potencial patogénico)